พันธุวิศวกรรมพืช (Genetic Engineering of Plants)

โดย...วราพงษ์ ชมาฤกษ์


บทนำ
          การถ่ายเทลักษณะทางพันธุกรรม (genetic manipulation) จากสิ่งพืชพันธุ์หนึ่งไปสู่อีกพันธุ์หนึ่ง มีการทำกันมานานหลายร้อยปีแล้วโดยนักปรับปรุงพันธุ์ และงานปรับปรุงพันธุ์พืชก็ได้กลายเป็นสาขาวิชาที่ทันสมัยสาขาหนึ่งของพันธุศาสตร์ประยุกต์ นักปรับปรุงพันธุ์พืชได้พัฒนาโครงการปรับปรุงพันธุ์พืชเพื่อนำเอาคุณลักษณะที่ต้องการถ่ายทอดไปสู่สายพันธุ์ที่ทำการปรับปรุง และพยายามรักษาลักษณะที่ถ่ายทอดไปนั้นให้คงอยู่ได้ ดังจะเห็นได้ว่าผลผลิตของพืชเศรษฐกิจสำคัญเช่น ข้าวโพดและข้าวสาลีเพิ่มขึ้นอย่างสม่ำเสมอในระยะ 60 ปีที่ผ่านมา อย่างไรก็ตามวิธีการปรับปรุงพันธุ์พืชแบบดั้งเดิมต้องใช้เวลานานและมีความไม่แน่นอน การที่จะถ่ายทอดยีนหรือกลุ่มของยีนที่สนใจไปสู่พันธุ์ที่ต้องการปรับปรุง ด้วยวิธีการปรับปรุงพันธุ์พืชแบบดั้งเดิมจะต้องทำการผสมพันธุ์ระหว่างต้นพ่อและต้นแม่ จากนั้นจะต้องทำการผสมกลับไปยังต้นแม่หลายๆครั้งจนกระทั่งได้ต้นลูกที่มียีนหรือกลุ่มของยีนที่ควบคุมลักษณะที่นักปรับปรุงพันธุ์ต้องการ กระบวนการปรับปรุงพันธุ์แบบนี้จำกัดอยู่เฉพาะพืชที่สามารถผสมพันธุ์กันได้เท่านั้น และบางครั้งยีนที่นอกเหนือไปจากที่นักปรับปรุงพันธุ์ต้องการจะถูกถ่ายทอดไปด้วย
          เทคนิคดีเอ็นเอสายผสม (Recombinant DNA techniques) จะช่วยขจัดปัญหาเหล่านี้ได้โดยช่วยให้นักพันธุศาสตร์พืช สามารถจำแนกและโคลนยีนที่ควบคุมลักษณะที่ต้องการเช่นลักษณะต้านทานต่อโรคหรือแมลง แล้วถ่ายทอดยีนนี้ไปยังพันธุ์พืชที่ดีอยู่แล้วเพียงแต่ขาดคุณลักษณะต้านทานโรคหรือแมลงได้โดยไม่จำเป็นต้องมีการผสมพันธุ์แบบอาศัยเพศ กระบวนการปรับปรุงพันธุ์ด้วยวิธีนี้จะใช้เวลาน้อยกว่าเพราะต้นพืชที่ถูกถ่ายฝากยีนจะมีการแสดงออกของยีนทำให้สามารถคัดเลือกต้นที่มีลักษณะที่ต้องการได้โดยตรง พืชมีคุณลักษณะเฉพาะด้านชีววิทยาที่สามารถนำมาใช้เป็นประโยชน์ด้วยเทคนิคดีเอ็นเอสายผสม คุณลักษณะพิเศษของพืชมีหลายอย่างเช่น 1) รูปแบบขั้นตอนการเจริญเติบโต, 2) กระบวนการที่พืชใช้ในการปรับตัวเมื่อต้องเผชิญกับสภาวะแวดล้อมที่เปลี่ยนไป, หรือ 3) กระบวนการสังเคราะห์แสง เป็นต้น ในบทความนี้จะได้กล่าวถึงเทคนิคพื้นฐานที่ใช้สำหรับการยักย้ายถ่ายเทลักษณะทางพันธุกรรมของพืชที่มีความสำคัญในการเกษตร

2. พืชมีคุณสมบัติทั้งข้อดีและข้อด้อยสำหรับการทำพันธุวิศวกรรม
          ด้วยการปรับปรุงพันธุ์พืชที่มีมายาวนานทำให้มีสายพันธุ์ที่มีการกลายพันธุ์ต่างๆอย่างมากมาย ซึ่งสายพันธุ์เหล่านี้สามารถนำมาใช้ประโยชน์ในการศึกษาทางพันธุศาสตร์ถึงระดับโมเลกุลได้ คุณสมบัติของพืชที่เป็นประโยชน์ในการศึกษาด้านพันธุศาสตร์เพราะพืชสามารถผสมตัวเองได้ เมื่อต้นพืชที่เป็น heterozygous ตรงตำแหน่งยีนที่เกิดการกลายพันธุ์มีการผสมตัวเอง ประชากรรุ่นลูกที่ได้จะประกอบไปด้วยต้นที่มีลักษณะเหมือนพ่อแม่, ต้นที่เป็น homozygous ตรงตำแหน่งยีนที่กลายพันธุ์ ,และต้นที่เป็น heterozygous และเนื่องจากพืชสามารถผลิตประชากรรุ่นลูกจำนวนมากๆได้ ทำให้สามารถจำแนกหาการกลายพันธุ์หรือการรวมตัวกันที่อาจเกิดขึ้นเพียงเล็กน้อยได้ (rare mutations and recombinations)  การจัดการยักย้ายถ่ายเทลักษณะทางพันธุกรรมในบางพืชก็สามารถทำได้อย่างละเอียดเพราะนักวิทยาศาสตร์ได้ใช้เวลาหลายปีทำการศึกษา transposon elements ซึ่งสามารถนำมาใช้ประโยชน์ในการถ่ายฝากยีนหรือในการจำแนกหายีนด้วยเทคนิค insertion mutation พืชยังมีคุณสมบัติในการเจริญเติบโต (regeneration capability) จากเนื้อเยื่อหรือจากเซลล์เพียงเซลล์เดียวได้อีก ทำให้การจัดการยักย้ายถ่ายเทพันธุกรรมทำได้โดยสะดวก นอกจากนี้เซลล์พืชยังไม่มีการเคลื่อนย้ายทำให้นักวิจัยสามารถติดตามดูโคลนของเซลล์ได้
             อย่างไรก็ตาม แม้ว่าพืชจะมีคุณลักษณะพิเศษซึ่งเหมาะกับการศึกษาทางพันธุศาสตร์ แต่พืชก็ยังมีข้อด้อยหลายประการเช่น พืชหลายชนิดมีจีโนม (ขนาดของพันธุกรรม) ขนาดใหญ่และเป็นพวกโพลีพลอยด์ (polyploidy) คือมีจีโนมอยู่หลายชุด ประมาณ 2 ใน 3 ส่วนของพืชตระกูลหญ้าจะเป็นพวกโพลีพลอยด์ พืชพวกมันฝรั่งจะมีจำนวนโครโมโซมตั้งแต่ 24 ถึง 144 พืชโพลีพลอยด์ยังทำให้เกิดการกระจายตัวเมื่อนำไปเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (somaclonal variation) คือต้นพืชที่เจริญเติบโตขึ้นมาจากเซลล์เพียงเซลล์เดียวก็มีโอกาสแตกต่างกันทางพันธุกรรมได้ ซึ่งจะเป็นปัญหาสำคัญในการทดลองถ่ายฝากยีนได้ ข้อด้อยอีกประการคือพืชใบเลี้ยงเดี่ยวส่วนใหญ่จะทำการถ่ายฝากยีนได้ยากกว่าพืชใบเลี้ยงคู่

พืชต้นใหม่สามารถเจริญเติบโตขึ้นมาจากเซลล์เดียวได้
          คุณลักษณะพิเศษของพืชที่สามารถเจริญเติบโตเป็นต้นใหม่ได้จากเซลล์เพียงเซลล์เดียวเป็นประโยชน์อย่างยิ่งต่องานวิจัยของนักพันธุศาสตร์ เมื่อต้นพืชเกิดมีบาดแผลกลไกซ่อมแซมจะสร้างกลุ่มเซลล์ที่เรียก แคลลัส (callus) ขึ้นมาห่อหุ้มบาดแผลไว้ หากนำเอากลุ่มเซลล์นี้มาเพาะเลี้ยงในอาหารเหลวที่มีส่วนผสมของธาตุอาหารและฮอร์โมนพืชที่เหมาะสมต่อการเจริญเติบโต กลุ่มเซลล์นี้จะมีการแบ่งตัวเป็นกลุ่มเซลล์แขวนลอย (suspension culture) เมื่อเซลล์แขวนลอยเหล่านี้ถูกนำไปเลี้ยงบนจานเพาะก็จะสามารถเจริญเป็นแคลลัสได้อีก ซึ่งบางครั้งอาจจะต้องใช้เซลล์พี่เลี้ยง (nurse culture) ช่วยให้การเจริญเติบโตดีขึ้น แล้วแคลลัสนั้นก็จะเจริญเป็นรากและต้น จนกระทั่งเติบโตสมบูรณ์สามารถให้ดอกผลได้ในที่สุด จากการศึกษาของนักวิทยาศาสตร์พบว่าพัฒนาการของเซลล์ในแคลลัสขึ้นอยู่กับสัดส่วนความเข้มข้นของฮอร์โมนพืชสองชนิดคือ auxins และ cytokinins ถ้าสัดส่วนของ auxins ต่อ cytokinins สูง เซลล์จะพัฒนาเป็นราก แต่ถ้าสัดส่วนต่ำเซลล์จะพัฒนาเป็นต้น เซลล์เหล่านี้ไม่ค่อยมีประโยชน์สำหรับการรับเอาชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการถ่ายฝาก เพราะเซลล์เหล่านี้มีผนังเซลล์ซึ่งมีเซลลูโลสเป็นองค์ประกอบ อย่างไรก็ตามผนังเซลล์สามารถถูกกำจัดออกไปได้ด้วยเอ็นไซม์เซลลูเลสที่สกัดจากเชื้อราบางชนิด (รูปที่ 1) เซลล์ที่ปราศจากผนังเซลล์นี้เรียกว่า Protoplast ซึ่งมีเยื่อหุ้มเซลล์ (cell membrane) ห่อหุ้มเอาไว้ Protoplast นี้สามารถรับเอาโมเลกุลขนาดใหญ่เช่นชิ้นส่วนดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์และสามารถเจริญจนเป็นพืชต้นใหม่ได้
          ถึงแม้ว่า protoplast สามารถใช้ในการถ่ายฝากยีนได้ดีในพืชหลายชนิด แต่พืชที่มีความสำคัญทางการเกษตรโดยเฉพาะธัญพืช การพัฒนาจาก protoplast ให้เป็นพืชต้นใหม่มีความยุ่งยากมาก จนกระทั่งไม่นานมานี้นักวิจัยสามารถพัฒนาต้นใหม่จาก protoplast ที่มีการตัดต่อยีนโดยใช้ protoplast จากเซลล์ของคัพภะ (embryo) ของข้าวโพดและข้าว ได้มีการนำเอาเนื้อเยื่อคัพภะของพืชมาเพาะเลี้ยงในห้องทดลองมานานกว่าร้อยปีแล้ว และเนื้อเยื่อนี้ก็เป็นแหล่งที่สำคัญในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อด้วย ปัจจุบันนักวิจัยสามารถสร้างพันธุ์ข้าวโพดและข้าวใหม่ๆด้วยการตัดต่อยีนในเซลล์แขวนลอยจากเนื้อเยื่อคัพภะได้เป็นผลสำเร็จ

ภาพที่ 1 พัฒนาการของต้นพืชจากโปรโตพลาสต์

          เซลล์พืชที่แยกจากใบจะมีคลอโรพลาสต์อยู่จำนวนมาก, มีช่องว่างขนาดใหญ่เรียกว่า vacuole , และมีหนึ่งนิวเคลียส  องค์ประกอบเหล่านี้ถูกห่อหุ้มด้วย plasma membrane และผนังเซลล์ (cell wall) ซึ่งสามารถกำจัดออกด้วยการแช่ในสารละลายที่มีเอ็นไซม์เซลลูเลส ในสารละลายนี้จะใส่น้ำตาลและเกลือเพื่อช่วยรักษาระดับ osmotic balance ของเซลล์และเพื่อช่วยให้โปรโตพลาสต์ไม่ถูกย่อย เมื่อเศษชิ้นส่วนอื่นๆของเซลล์ถูกแยกออกไปแล้ว โปรโตพลาสต์จะถูกวางลงบนกระดาษกรองที่วางอยู่บนเซลล์พี่เลี้ยง (nurse cells) ในจานเพาะอีกทีหนึ่ง  กระดาษกรองจะกั้นไม่ให้เซลล์เคลื่อนผ่านไปมาแต่ธาตุอาหารที่จำเป็นต่อการเจริญและโมเลกุลอื่นๆ ที่ผลิตโดยเซลล์พี่เลี้ยงจะสามารถซึมผ่านกระดาษกรองนี้ได้ โปรโตพลาสต์ก็จะแบ่งตัวและเจริญเป็นโคโลนีขนาดเล็ก ปกติแล้วเซลล์พืชส่วนใหญ่ไม่จำเป็นต้องมีเซลล์พี่เลี้ยง แล้วโคโลนีขนาดเล็กๆนี้จะถูกถ่ายไปยังอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อที่มีฮอร์โมนไซโตไคนินสูงและมีฮอร์โมนออกซินต่ำ ลำต้นจะพัฒนาหลังจาก 2 ถึง 4 สัปดาห์ จากนั้นเนื้อเยื่อที่เพาะเลี้ยงไว้จะถูกถ่ายไปสู่กล่องพลาสติค (Magenta box) ที่บรรจุอาหารเพาะเลี้ยงที่ไม่มีฮอร์โมนไซโตไคนินและมีฮอร์โมนออกซินต่ำเพื่อกระตุ้นให้สร้างราก เมื่อรากเจริญดีแล้วต้นพืชจะถูกย้ายลงดินเพื่อให้เจริญเติบโตเป็นต้นใหญ่ต่อไป

 


ชิ้นส่วนที่ตัดจากใบพืชสามารถใช้สำหรับการถ่ายฝากยีน
               การพัฒนาเป็นต้นพืชจาก protoplast เป็นไปได้ค่อนข้างยาก แม้แต่ในพืชที่เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ง่ายก็ตาม จนกระทั่งนักวิจัยได้พัฒนาวิธีการถ่ายฝากยีนโดยใช้ชิ้นส่วนของใบ (leaf disk technique) เทคนิคนี้มีความสำคัญยิ่งเพราะสามารถนำไปใช้ร่วมกับวิธีการถ่ายฝากยีนที่มีประสิทธิภาพโดยใช้ Ti plasmid ซึ่งเป็นพลาสมิดที่มีอยู่ในแบคทีเรีย Agrobacterium tumefaciens เนื้อเยื่อพืชต้องเกิดบาดแผลจึงจะทำให้ยีนที่อยู่ใน Ti plasmid ถูกถ่ายฝากไปยังเนื้อเยื่อเป้าหมายได้ ในบางครั้งชิ้นส่วนของรากหรือชิ้นส่วนของต้นพืชก็ถูกใช้เป็นเนื้อเยื่อเป้าหมายในการถ่ายฝากยีนด้วย ใบพืชนับเป็นแหล่งของเซลล์ที่สามารถจะพัฒนาเป็นต้นใหม่ได้ดี เซลล์ที่อยู่บริเวณขอบของชิ้นส่วนใบที่ตัดมาจะเริ่มมีการพัฒนาใหม่ และเมื่อนำเอาชิ้นส่วนใบนี้ไปเพาะเลี้ยงในอาหารที่มี Agrobacterium เซลล์เหล่านี้จะรับเอาชิ้นส่วนของดีเอ็นเอได้ง่าย (รูปที่ 2) แล้วชิ้นส่วนใบนี้จะถูกย้ายไปยังอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อที่มีเซลล์พี่เลี้ยงซึ่งจะกระตุ้นให้มีการพัฒนาเป็นลำต้น เซลล์ที่มี Ti plasmid อยู่จะถูกคัดเลือกโดยนำไปเพาะบนอาหารที่มียาปฏิชีวนะที่เหมาะสมเช่น กานามัยซิน (kanamycin) และในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อนี้ยังมียาปฏิชีวนะอื่นเช่น cefotaxime เพื่อกำจัด Agrobacterium ลำต้นจะพัฒนาในอีกไม่กี่สัปดาห์ต่อมา แล้วลำต้นใหม่นี้จะถูกย้ายไปยังอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ชักนำให้รากพัฒนาขึ้นต่อไป กระบวนการทั้งหมดนี้จะใช้เวลาตั้งแต่ 4 ถึง 7 สัปดาห์ซึ่งเร็วกว่าการเพาะเลี้ยง protoplast มาก เทคนิคนี้สามารถนำไปใช้กับพืชใบเลี้ยงคู่ได้ดีเช่นกัน

Ti plasmid จาก Agrobacterium ทำให้เกิดโรคปุ่มปม Crown Gall Tumors ในพืช
              โรคปุ่มปมเป็นอาการเนื้องอกในพืชเมื่อถูกเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium เข้าทำลาย (รูปที่ 3) เซลล์เนื้องอกเหล่านี้มีคุณสมบัติในการเจริญอย่างอิสระและไร้รูปแบบ เมื่อนำไปเพาะเลี้ยงเซลล์เหล่านี้สามารถเจริญได้แม้ไม่มีฮอร์โมนพืชที่จำเป็นสำหรับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ และเซลล์เหล่านี้ยังสามารถคงคุณสมบัตินี้แม้ว่าจะไม่มีเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium อยู่ด้วย สิ่งที่เป็นตัวชักนำให้เกิดเนื้องอกได้ก็คือพลาสมิดซึ่งสามารถถ่ายทอดชิ้นส่วนของดีเอ็นเอให้แทรกเข้าไปอยู่ในโครโมโซมพืชอาศัยที่เชื้อเข้าทำลาย Ti plasmid เป็นชิ้นส่วนดีเอ็นเอวงกลมคู่ขนานขนาดประมาณ 200 kb ซึ่งสามารถแบ่งตัวได้อย่างอิสระจากโครโมโซมของแบคทีเรีย 
           Ti plasmid สามารถคงอยู่ใน Agrobacterium ได้เพราะมีชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่เรียกว่า T-DNA ซึ่งบรรจุกลุ่มยีนที่สังเคราะห์กรดอะมิโนที่เรียกว่า opines เซลล์พืชที่ถูกเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium เข้าทำลายจะผลิตกรดอะมิโนนี้ออกมาแต่ไม่สามารถใช้ประโยชน์ได้ แต่ T-DNA จะมีกลุ่มยีนที่สังเคราะห์เอ็นไซม์ซึ่งทำหน้าที่ย่อยสลาย opines ได้ ดังนั้น opines อาจทำหน้าที่เป็นแหล่งอาหารให้กับเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium ก็เป็นได้ ยีนกลุ่มที่สองของ T-DNA จะเป็นสาเหตุให้เซลล์พืชเจริญอย่างไร้รูปแบบ ยีนเหล่านี้เช่นยีน iaaM และยีน iaaH ซึ่งทำหน้าที่สังเคราะห์เอ็นไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการผลิตฮอร์โมน auxin อีกยีนหนึ่งคือยีน iptZ ซึ่งสังเคราะห์เอ็นไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการผลิตฮอร์โมนพืชอีกชนิด ฮอร์โมนสองชนิดนี้จะกระตุ้นให้เซลล์พืชที่ถูกเชื้อแบคทีเรียเข้าทำลายมีการแบ่งเซลล์และยังมีผลกับเซลล์ที่อยู่ข้างเคียงอีกด้วย

ภาพที่ 2 พัฒนาการของต้นพืชจากแผ่นใบที่ถูกตัดเป็นวง และจุ่มใน Agrobacterium
          วงแผ่นใบถูกตัดและวางลงในจานเพาะ จากนั้นสารละลายที่มีเชื้อ Agrobacterium ถูกเทลงในจานเพาะและทิ้งไว้ 2-3 นาที วงแผ่นใบจะถูกย้ายไปวางบนอาหารในจานเพาะที่มีเซลล์พี่เลี้ยงอยู่ด้วย เซลล์บาดแผลที่อยู่ขอบของวงแผ่นใบจะผลิตสารบางอย่างออกมา ซึ่งกระตุ้นให้เชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium ระบาดเข้าในเซลล์พืช เซลล์จะเจริญเป็นแคลลัสและถูกชักนำให้พัฒนาเป็นต้นและราก ในอาหารเพาะเลี้ยงที่มียาปฏิชีวนะเช่น cefotaxime ซึ่งมีฤทธิ์ฆ่าเชื้อ Agrobacterium แต่ไม่เป็นอันตรายต่อเซลล์พืช
 

ภาพที่ 3 Agrobacterium เป็นสาเหตุทำให้เกิดโรคปุ่มปมในพืช
           เมื่อต้นพืชที่มีบาดแผลถูกเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium เข้าระบาดทำลาย เซลล์ของเชื้อแบคทีเรียจะไม่ได้เข้าสู่เซลล์พืช แต่จะถ่ายเทชิ้นส่วนของดีเอ็นเอเรียกว่า T-DNA เข้าสู่เซลล์พืช T-DNA  เป็นชิ้นส่วนดีเอ็นเอจาก Ti plasmid (tumor inducing plasmid) ซึ่งเป็นโมเลกุลวงกลมของดีเอ็นเอที่อยู่นอกโครโมโซมของเชื้อแบคทีเรีย กลุ่มยีนที่อยู่ใน T-DNA จะเริ่มทำงานผลิตสารบางอย่าง(ฮอร์โมนพืช)ออกมากระตุ้นให้เซลล์แบ่งตัวแบบที่ควบคุมไม่ได้จนเกิดเป็นปุ่มปมที่เรียกว่า crown gall tumor
 

 

         

T-DNA ซึ่งเป็นส่วนประกอบของ Ti plasmid จะถูกถ่ายทอดเข้าสู่เซลล์พืช
                มีองค์ประกอบสามประการที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการกระตุ้นให้เกิดอาการปุ่มปมโดย Ti plasmid (รูปที่ 4) องค์ประกอบแรกคือ T-DNA ซึ่งเป็นชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่จะถูกถ่ายทอดเข้าสู่เซลล์พืช องค์ประกอบที่สองคือกลุ่มยีน vir (virulence genes) ที่มีอยู่ใน Ti plasmid จะสังเคราะห์โปรตีนที่จำเป็นสำหรับการถ่ายฝากยีนเข้าสู่เซลล์พืช องค์ประกอบที่สามคือกลุ่มยีนที่มีอยู่ในโครโมโซมของเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium ซึ่งเกี่ยวข้องกับกระบวนการจับตัวกันระหว่างเชื้อแบคทีเรียกับเซลล์พืชเพื่อการถ่ายฝากยีน
            กลุ่มยีน vir ในเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium จะถูกกระตุ้นให้ทำงานโดยสารเคมีที่สร้างขึ้นมาโดยเซลล์ที่บาดเจ็บเป็นแผล เมื่อ vir genes ถูกกระตุ้น,ชิ้นส่วนของ T-DNA จะถูกตัดออกมาจากพลาสมิด T-DNA นี้จะมีชิ้นส่วนดีเอ็นเอของ Ti plasmid ขนาดความยาว 25 bp ปิดหัวปิดท้ายอยู่เรียกว่า borders ซึ่งเกี่ยวข้องกับการตัดชิ้นส่วนของ T-DNA ออกมา กระบวนการนี้มีสองขั้นตอน ขั้นตอนแรก border ด้านขวาจะถูกตัดตรงตำแหน่งระหว่างลำดับเบสที่สามและสี่ ขั้นตอนที่สอง border ด้านซ้ายจะถูกตัด ทำให้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอสายเดี่ยวจะถูกปลดปล่อยออกมาจาก Ti plasmid ส่วนกระบวนการถ่ายทอดชิ้นส่วนดีเอ็นเอไปสู่เซลล์พืชจะคล้ายคลึงกับกระบวนการสืบพันธุ์ของแบคทีเรีย (bacterial conjugation) สำหรับหน้าที่ของโปรตีนที่สังเคราะห์โดยยีน vir ในการถ่ายทอดดีเอ็นเอยังไม่ทราบแน่ชัด แต่การเพิ่มจำนวนก็อปปี้ของยีน vir ในแบคทีเรีย Agrobacterium จะทำให้มีการผลิต T-DNA มากขึ้นและทำให้มีการถ่ายฝากชิ้นส่วนดีเอ็นเอมากขึ้นเมื่อชิ้นส่วนของ T-DNA เข้าสู่เซลล์พืชก็จะต้องผ่านเข้าสู่นิวเคลียสและแทรกตัวเองเข้าในโครโมโซมของพืช โดยปกติชิ้นส่วนของ T-DNA จำนวนหลายๆก็อปปี้จะแทรกเข้าไปอยู่ในโครโมโซมพืชตรงที่เดียวกันตำแหน่งใดตำแหน่งหนึ่งโดยสุ่ม แต่รายละเอียดของกลไกนี้ยังไม่เป็นที่ทราบ

ภาพที่ 4 การถ่ายทอด T-DNA จากเชื้อ Agrobacterium เข้าสู่เซลล์พืช

                เซลล์พืชที่ได้รับบาดเจ็บจะปล่อยสารชนิดหนึ่งออกมา ซึ่งจะไปกระตุ้นการทำงานของกลุ่มยีน vir ที่อยู่ใน Ti plasmid ของเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium โปรตีนที่ถูกสร้างโดยกลุ่มยีน vir จะทำหน้าที่เกี่ยวข้องกับขบวนการถ่ายทอด T-DNA เข้าสู่เซลล์พืช  T-DNA จะมีส่วนของดีเอ็นเอที่มีลำดับเบสคล้ายคลึงกันซ้ำๆ กัน (imperfect repeats) ปิดหัวท้ายไว้เรียกว่า left border (LB) และ right border (RB) การเคลื่อนย้ายชิ้นส่วนของ T-DNA เริ่มจากรอยตัด  (nick) ตรง RB แล้วตามด้วยรอยตัดตรง LB ทำให้ได้ชิ้นส่วน T-DNA สายเดี่ยว แล้วชิ้นส่วนของ T-DNA นี้จะเคลื่อนย้ายเข้าสู่เซลล์พืชด้วยกระบวนการที่ยังไม่มีคำอธิบายแน่ชัด จากนั้น T-DNA จะแทรกตัวเข้าสู่โครโมโซมพืชแบบสุ่ม ส่วนตรงบริเวณ T-DNA สายเดี่ยวที่เหลืออยู่ใน Ti plasmid จะถูกซ่อมแซมด้วยขบวนการจำลองตัวของดีเอ็นเอ  (DNA replication) ดังนั้นเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium ก็จะไม่มีการสูญเสียข้อมูลทางพันธุกรรมใดๆเลยเมื่อมีการถ่ายทอดชิ้นส่วนดีเอ็นเอไปสู่เซลล์พืช


T-DNA ถูกดัดแปลงเพื่อใช้สำหรับพาหะนำพายีนในการถ่ายฝาก
               เทคนิคที่เรียกว่า cointegration ถูกนำมาใช้เป็นครั้งแรกในการถ่ายฝากยีนโดย T-DNA, Ti plasmid และ Agrobacterium (รูปที่ 5) เทคนิคนี้ถูกพัฒนาขึ้นมาเพื่อหลีกเลี่ยงปัญหาในการจัดการกับชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีขนาดใหญ่อย่างเช่น Ti plasmid เป็นต้น  เทคนิคนี้จะเริ่มโดยการที่ T-DNA จะถูกโคลนเข้าใน standard cloning vector ของเชื้อแบคทีเรีย E. coli  จากนั้นยีนของพืชจะถูกโคลนเข้าไปยัง cloning site ตรงตำแหน่งที่สองที่อยู่ใน vector และ vector ดังกล่าวนี้เรียกว่า intermediate vector ซึ่งจะถูกถ่ายทอดเข้าสู่เซลล์ของเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium ที่มี Ti plasmid อยู่ กระบวนการแลกเปลี่ยนชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ  (recombination) ระหว่าง intermediate vector กับ Ti plasmid จะเกิดขึ้นตรงตำแหน่งที่มีลำดับเบสเหมือนกัน เมื่อเชื้อ Agrobacterium เข้าทำลายเซลล์พืช พลาสมิดที่เกิดการแลกเปลี่ยนชิ้นส่วนดีเอ็นเอ (recombinant plasmid) ก็จะถูกถ่ายทอดเข้าสู่เซลล์พืช พลาสมิดของ E.coli ที่ใช้ในกระบวนการถ่ายฝากยีนนี้เรียกว่า integrative plasmid เพราะว่ามีการดัดแปลงให้เป็นส่วนหนึ่งของ Ti plasmid
           ปัจจุบันวิธีการถ่ายฝากยีนที่เป็นมาตรฐานคือ binary system เทคนิคนี้ถูกพัฒนาขึ้นเนื่องจากนักวิจัยพบว่า T-DNA และ Ti plasmid ทำหน้าที่สำคัญในการถ่ายฝากยีนโดยแยกกันคนละส่วนอยู่แล้ว ดังนั้นยีนที่เกี่ยวข้องในแต่ละส่วนนี้สามารถบรรจุไว้ใน vector ที่ต่างกันได้ สำหรับ binary vector นี้จะมี border ข้างซ้ายและขวาขนาด 25 bp จาก T-DNA ซึ่งจำเป็นต่อการแยกตัวออกมาจาก  vector และแทรกเข้าสู่โครโมโซมพืช ส่วนของกลุ่มยีนที่สังเคราะห์ฮอร์โมนพืชอาจถูกตัดออกไปเพื่อให้ vector สามารถรับเอาชิ้นส่วนดีเอ็นเอแปลกปลอม(ที่ต้องการถ่ายฝากไปยังเซลล์พืช)ขนาดใหญ่ขึ้นได้ ในขณะเดียวกันเมื่อกลุ่มยีนเหล่านี้ถูกกำจัดออกไป พืชที่ถูกแบคทีเรีย Agrobacterium เข้าทำลายก็จะไม่เกิดโรคปุ่มปม สำหรับกลุ่มยีน vir จะสามารถบรรจุไว้ใน vector อีกชนิดที่เรียกว่า helper plasmid โปรตีนที่สังเคราะห์โดยกลุ่มยีนนี้จะถูกส่งไปทำงานที่อื่นได้ (trans acting proteins)    การถ่ายฝากยีนด้วยระบบ   binary   vector  แสดงให้เห็นในรูปที่ 6 ปัจจัยสำคัญสำหรับการพัฒนาเวคเตอร์จาก T-DNA คือ ยีนเครื่องหมายเพื่อช่วยคัดเลือก (selectable marker genes) เช่น neomycin phosphotransferase II (NPTII) และ dihydrofolate reductase ยีนเครื่องหมายเหล่านี้จะถูกบรรจุอยู่ระหว่าง border ซ้ายและขวา ดังนั้นจึงถูกถ่ายฝากไปยังเซลล์พืชด้วย นอกจากนี้ยังมียีนเครื่องหมายอีกยีนหนึ่งเพื่อช่วยให้การคัดเลือกหาเวคเตอร์ในแบคทีเรีย E.coli สะดวกขึ้น binary vector จะแตกต่างจาก integrative vector คือว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการถ่ายฝากไปยังเซลล์พืชจะถูกบรรจุอยู่ในพลาสมิดต่างหากจาก Ti plasmid ในเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium
           ตัวอย่างของการใช้ binary vector เพื่อถ่ายฝากยีนในพืชได้มาจากการทดลองที่ต้องการใช้ antisense RNA เพื่อควบคุมการแสดงออกของยีน เอนไซม์ Polygalacturonase (PG) เป็นเอนไซม์ที่ย่อยผนังเซลล์โดยการย่อยสลายเพคติน การลดระดับการแสดงออกของยีน PG จะช่วยทำให้ผลไม้เกิดการช้ำได้ยากขึ้น ในการพัฒนาbinary vector สำหรับ antisense RNA นั้น ชิ้นส่วนดีเอ็นเอของยีน PG ด้านปลาย 5’ จะถูกบรรจุเข้าใน vector โดยสลับลำดับเบสกลับหัวกลับหาง นอกจากนี้ CaMV promotor จากไวรัสโรคด่างในกะหล่ำดอก (cauliflower mosaic virus) ก็ถูกบรรจุเข้าไปด้วย vector นี้จะถูกถ่ายทอดเข้าสู่เชื้อ Agrobacterium แล้วก็ถูกถ่ายฝากเข้าสู่เซลล์ของมะเขือเทศในที่สุด ผลมะเขือเทศสุกจากต้นที่ถูกดัดแปลงพันธุกรรมจะมีระดับกิจกรรมของเอนไซม์ PG ลดลงอย่างเห็นได้ชัด แต่อย่างไรก็ตามผลมะเขือเทศสุกดัดแปลงพันธุกรรมก็ยังอ่อนและช้ำง่ายเหมือนผลมะเขือเทศจากต้นปกติ อาจเป็นเพราะเอนไซม์ PG เป็นเพียงหนึ่งในหลายๆ ปัจจัยที่มีผลทำให้ผลมะเขือเทศอ่อน เพราะปัจจัยอีกตัวหนึ่งก็คือ ethylene และในปัจจุบันการทำให้มะเขือเทศไม่สุกจนอ่อนด้วยการใช้ antisense RNA สำหรับเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการผลิต ethylene ก็ประสบผลสำเร็จแล้ว เกษตรกรผู้ผลิตมะเขือเทศพันธุ์ดังกล่าวสามารถขนส่งผลผลิตได้โดยไม่เกิดการชอกช้ำ เมื่อถึงตลาดแล้วจึงใช้ ethylene ทำให้ผลสุกได้
        

ภาพที่ 5 การถ่ายฝากยีนสู่เซลล์พืชด้วยเทคนิค cointegration โดยการใช้ T-DNA, Ti plasmid  และ Agrobacterium ---->

                ยีนที่ถูกโคลนออกมาสามารถนำไปถ่ายฝากเข้าสู่เซลล์พืชโดยเริ่มต้นจากการนำยีนดังกล่าวใส่เข้าไปในพลาสมิดที่สามารถแบ่งตัวได้ในเชื้อแบคทีเรีย E. coli ซึ่งพลาสมิดนี้มีชิ้นส่วนของ T-DNA เป็นองค์ประกอบด้วย พลาสมิดชนิดนี้เรียกว่า Intermediate shuttle vector เช่นพลาสมิด pBR322 เป็นต้น หลังจากโคลนยีนเข้าตรง cloning site แล้ว พลาสมิดนี้จะถูกนำเข้าสู่เซลล์ของเชื้อแบคทีเรีย E.coli เซลล์ที่มีพลาสมิดอยู่จะถูกคัดเลือกโดยการนำไปเพาะบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มียาปฏิชีวนะแอมพิซิลลินอยู่ จากนั้นพลาสมิดจะถูกถ่ายทอดจากเชื้อ E.coli ไปสู่เชื้อ Agrobacterium โดยการผสมพันธุ์ (mating) เมื่อพลาสมิดของ E. coli เข้าสู่เซลล์ของ Agrobacterium แล้วก็จะแทรกตัวเข้าอยู่ใน Ti plasmid ระหว่าง LB และ RB ด้วยวิธีการแลกเปลี่ยนชิ้นส่วนดีเอ็นเอตรงบริเวณที่มีลำดับเบสเหมือนกัน (homologous recombination) ส่วนพลาสมิดที่ไม่สามารถแทรกตัวเข้าไปใน Ti plasmid ได้ ก็จะไม่มีการสะสมหรือเพิ่มปริมาณเนื่องจากไม่มีองค์ประกอบที่จำเป็นสำหรับการจำลองตัวเองในเซลล์ของเชื้อ Agrobacterium (lack of an origin of replication for Agrobacterium) เซลล์เชื้อ Agrobacterium ที่มีพลาสมิดลูกผสม (recombinant Ti plasmid) นี้ จะถูกคัดเลือกและนำไปเข้าทำลายเซลล์พืชต่อไป เซลล์พืชที่รับเอา T-DNA เข้าไป (ซึ่งจะมียีนที่ถ่ายฝากอยู่ด้วย) จะถูกจำแนกได้โดยใช้ยีน NPTII ซึ่งต้านทานยาปฏิชีวนะ kanamycin

 

   
   

 <----  ภาพที่ 6 การถ่ายฝาก antisense ของยีน polygalacturonase เข้าสู่เซลล์มะเขือเทศ โดยใช้ binary vector

                ในระบบ binary vector จะมีพลาสมิดอยู่สองตัว ในพลาสมิดตัวแรก T-DNA จะถูกกำจัดออกไปให้เหลือแต่ LB และ RB โดยมี NPTII ยีน เป็น selectable marker อีกส่วนหนึ่งของระบบ binary vector คือ helper Ti plasmid ซึ่งเป็น Ti plasmid ที่ไม่มี T-DNA แต่ยังคงมีกลุ่มยีน vir อยู่ ซึ่งพลาสมิดนี้จะอยู่ในเซลล์ Agrobacterium  การทดลองนี้ก็เพื่อศึกษาหน้าที่ของเอ็นไซม์ polygalacturonase (PG) ในการเกิดรอยช้ำของผลมะเขือเทศ  สมมติฐานมีอยู่ว่าถ้าระดับการสร้างเอ็นไซม์ PG ในเซลล์พืชลดลง ผลมะเขือเทศอาจจะเกิดรอยช้ำได้ยากขึ้นก็เป็นได้  ชิ้นส่วนของยีน PG จากด้าน 5’ end ถูกเชื่อมต่อในทิศทางกลับกัน (antisense direction) เข้ากับโปรโมเตอร์ของไวรัสโรคด่างในกะหล่ำดอก (CaMV) แล้วถูกโคลนเข้าสู่ binary vector ตรงระหว่าง LB กับ RB แล้ว binary vector ก็ถูกถ่ายทอดเข้าสู่เซลล์ของ E. coli  เมื่อเซลล์ของ E.coli ที่มี antisense PG อยู่ถูกคัดเลือกและนำไปผสม (mate) กับเชื้อ Agrobacterium ซึ่งมี helper Ti plasmid อยู่ เมื่อถูกกระตุ้นด้วยเซลล์ที่บาดแผลของพืช ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอระหว่าง LB กับ RB (ในกรณีนี้ก็คือ antisense PG) จะแยกตัวออกจาก binary vector และถูกถ่ายทอดไปยังเซลล์พืช แล้วแทรกตัวเข้าสู่โครโมโซมพืช  เซลล์ที่ถูกถ่ายฝากยีนจะถูกคัดเลือกโดยยีนต้านทานยาปฏิชีวนะกานามัยซิน อย่างไรก็ตามแม้เซลล์ที่มี antisense PG จะผลิตเอ็นไซม์ polygalacturonase ในระดับต่ำ แต่ผลของมะเขือเทศก็ยังนิ่มอยู่ อาจเป็นเพราะว่ายังมีเอนไซม์อื่นๆอีกหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับความแข็งแรงของเนื้อมะเขือเทศ


การใช้ reporter genes เพื่อตรวจสอบการทำงานของยีนในการถ่ายฝากยีนพืช
           สิ่งที่น่าสนใจและสำคัญสำหรับการศึกษาทางชีววิทยาของพืชก็คือปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชกับสิ่งแวดล้อม โดยปกติพืชมักจะไวต่อปัจจัยแวดล้อมต่างๆเช่น แสง, แรงโน้มถ่วง, และอื่นๆ ซึ่งปัจจัยแวดล้อมเหล่านี้จะชักนำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีน การวัดผลการแสดงออกของยีนจะใช้วิธีวิเคราะห์เชิงปริมาณที่รวดเร็ว ในขณะที่การวิเคราะห์ทางกายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์จะให้ข้อมูลที่จำเพาะเจาะจง ปัจจุบันมียีนจากแบคทีเรีย E. coli ที่ผลิตเอ็นไซม์ b-glucuronidase (GUS) ซึ่งถูกนำมาใช้เป็น reporter gene อย่างแพร่หลาย (รูปที่ 7) เอ็นไซม์นี้ก็เหมือนกับเอ็นไซม์ b-galactosidase ของ E. coli ที่ใช้กับเซลล์สัตว์ เพียงแต่เอ็นไซม์นี้จะใช้ glucuronides เป็นสารสำหรับทำปฏิกิริยาด้วย ประโยชน์ของยีนนี้ในแง่ที่ใช้เป็น reporter gene ก็คือ ระดับของเอ็นไซม์นี้ในพืชจะต่ำมากจนแทบวัดไม่ได้ เนื่องจากเอ็นไซม์นี้จะมีมากในสัตว์ที่มีกระดูกสันหลังและในจุลินทรีย์เท่านั้น เมื่อเซลล์พืชที่มีการแสดงออกของยีน b-glucuronidase (ที่ได้จากการถ่ายฝาก) ถูกนำไปเลี้ยงบนอาหารที่มีสาร X-glucuronidase (X-glu  คล้ายกับ X-gal) แบคทีเรียจะผลิตสารสีน้ำเงินออกมา ทำให้สามารถวิเคราะห์การแสดงออกของยีน GUS นี้ได้ด้วยเครื่องวัดสี (Fluorometer) แต่การใช้ยีน b-glucuronidase มีข้อด้อยอย่างหนึ่งคือต้องทำให้เซลล์ตายเพื่อทำการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนได้ ต่อมาได้มีการพัฒนา reporter gene ใหม่คือ ยีน luciferase ซึ่งสามารถวัดการแสดงออกของยีนในเซลล์ที่ยังมีชีวิตอยู่ได้ เมื่อสาร luciferin กับ ATP ถูกเติมลงในเซลล์ที่มียีน luciferase อยู่ เอนไซม์ก็จะเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชั่นของสาร luciferin แล้วปลดปล่อยแสง พร้อมกับคาร์บอนไดออกไซด์และ AMP ออกมา แสงที่ถูกปลดปล่อยออกมาจะถูกวัดด้วยเครื่องวัดแสง หรือด้วยการถ่ายภาพบนฟิล์ม

ไวรัสสามารถนำมาใช้เป็นเวคเตอร์ในการถ่ายฝากยีนสำหรับพืชได้
             ไวรัสมีวิวัฒนาการมาเพื่อให้สามารถแทรกจีโนมของมันเข้าไปสู่จีโนมของพืชที่มันเข้าทำลายได้ ด้วยคุณสมบัตินี้จึงถูกนำมาใช้ในการถ่ายฝากยีนสู่พืช ข้อได้เปรียบอีกประการคือการใช้ไวรัสเวคเตอร์ช่วยให้การถ่ายฝากยีนในพืชใบเลี้ยงเดี่ยวเช่นข้าวโพดสะดวกยิ่งขึ้น ไวรัสชนิดนี้คือ geminiviruses ซึ่งมีจีโนมเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single-stranded DNA) 2 โมเลกุล (A และ B) แต่ละโมเลกุลจะมีการจำลองตัวเอง (replication) กลายเป็นโมเลกุลสายคู่ (double-stranded DNA) โมเลกุล A โดยลำพังก็สามารถจำลองตัวเองได้ในเซลล์พืช แต่โมเลกุล B จำเป็นสำหรับการเข้าทำลายพืช แต่การจะเข้าทำลายเซลล์พืชต้องอาศัยยีนที่มีอยู่บนทั้งโมเลกุล A และ B เนื่องจาก DNA ของโมเลกุล A ที่อยู่ในรูป replicative form (เป็นสายคู่) ที่จะเข้าทำลายเซลล์พืชจะไม่มีโปรตีนห่อหุ้ม ดังนั้นยีนส่วนที่ทำหน้าที่สังเคราะห์ coat protein จึงอาจถูกกำจัดออกไปเพื่อให้มีที่เหลือพอที่จะใส่ยีนสำหรับถ่ายฝากเข้าไปในไวรัสได้ เวคเตอร์ที่สร้างจาก TGMV (tomato golden mosaic virus) ก็ถูกสร้างขึ้นโดยหลักการนี้คือยีน NPTII ถูกใส่เข้าไปแทนที่ยีนที่สังเคราะห์โปรตีนห่อหุ้มที่เรียกว่า DNA A-neo แล้วชิ้นส่วนของดีเอ็นเอนี้จะถูกใส่เข้าไประหว่าง LB(left border) และ RB(right border)  ของ T-DNA แล้วถูกโคลนใน Agrobacterium binary system (รูปที่ 8) เมื่อแบคทีเรียนี้ถูกฉีดเข้าสู่ต้นพืช(ต้นยาสูบ)ที่มี DNA B ถ่ายฝากเข้าไปแล้ว จะพบว่ามีการจำลองตัวของโมเลกุล DNA A ที่มียีน NPTII อยู่  เมื่อใช้ยีน GUS เป็น reporter gene ก็จะให้ผลเช่นเดียวกัน แม้ว่าวิธีการนี้จะให้ผลดีแต่ก็มีข้อด้อยคือขนาดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่จะใส่เข้าไปใน DNA A เพื่อจะถ่ายฝากไม่สามารถใส่ชิ้นขนาดใหญ่ๆได้ และในหลายๆการทดลองพบว่าโมเลกุลของ DNA A จะสูญเสียยีน GUS ไปหลังจากเข้าทำลายเซลล์พืชแล้ว ทั้งนี้อาจเนื่องจากกระบวนการคัดเลือก (strong selective pressure) ที่คัดไว้แต่โมเลกุลที่มีขนาดใกล้เคียงกับ wild type DNA A การจะนำเอาไวรัสนี้มาใช้เป็นเวคเตอร์ในการถ่ายฝากยีนจึงจะต้องมีการศึกษากลไกทางชีววิทยาของไวรัสนี้ให้เข้าใจยิ่งขึ้น

        

ภาพที่ 7 GUS เวคเตอร์ ---->

              พลาสมิดชนิดนี้เป็น binary vector ที่ใช้จำแนกลำดับเบสที่มีหน้าที่ควบคุมการแสดงออกยีน เช่น tissue-specific enhancer ยีนที่ต้องการถ่ายฝากจะถูกโคลนเข้าไปตรงตำแหน่งใกล้กับยีน gusA ซึ่งผลิตเอ็นไซม์ b-glucuronidase ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่อยู่ระหว่าง LB และ RB จะถูกถ่ายทอดไปสู่เซลล์พืช เซลล์พืชที่ถูกถ่ายฝากยีนจะต้านทานยาปฏิชีวนะกานามัยซินเพราะมียีน NPTII และจะถูกคัดเลือกโดยการนำไปเพาะเลี้ยงบนอาหารที่มียาปฏิชีวนะนี้อยู่ ระดับการทำงานของโปรโมเตอร์ที่ถูกโคลนจะสามารถตรวจสอบได้ทั้งทางเคมีและในเชิงปริมาณจากสีของโคโลนี GUS vector นี้สามารถใช้คัดเลือกเซลล์พืชที่รับเข้าพลาสมิดเข้าไปได้ด้วย

 


ปืนและกระแสไฟฟ้าช่วยถ่ายทอดชิ้นส่วนดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์พืชได้
           Ti plasmid ของแบคทีเรีย Agrobacterium ช่วยให้การถ่ายฝากยีนในพืชใบเลี้ยงคู่ได้อย่างมีประสิทธิภาพ แต่ในพืชใบเลี้ยงเดี่ยวมักไม่ค่อยประสบผล ดังนั้นการถ่ายฝากยีนในพืชใบเลี้ยงเดี่ยวจึงต้องมีวิธีการถ่ายทอดชิ้นส่วนดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์พืชด้วยวิธีการทางกายภาพโดยตรง การใช้กระแสไฟฟ้าช่วยกระตุ้น (electroporation) ให้เซลล์พืชรับเอาชิ้นส่วนของดีเอ็นเอสามารถใช้ได้ผลดี โดยปกติแล้ว พลาสมิดที่มีชิ้นส่วนของยีนที่ต้องการถ่ายฝากจะถูกเติมลงในสารแขวนลอยโปรโตพลาสของพืช แล้วของผสมนี้จะถูกกระตุ้นด้วยกระแสไฟฟ้าขนาด 200-600 V/cm หลังจากนั้นโปรโตพลาสจะถูกนำไปเลี้ยงบนอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อประมาณ 1-2 สัปดาห์ ก่อนที่จะถูกคัดเลือกหาเซลล์ที่รับเอาชิ้นส่วนของดีเอ็นเอเข้าไปแล้ว ในโปรโตพลาสของข้าวและข้าวโพดสามารถถ่ายฝากยีนด้วยวิธีนี้ด้วยประสิทธิภาพ 1 และ 0.1 เปอร์เซ็นต์  
          การใช้กระแสไฟฟ้ากระตุ้นยังต้องใช้โปรโตพลาสเป็นตัวรับขิ้นส่วนของดีเอ็นเอซึ่งมีความยุ่งยากในการเพาะเลี้ยงให้เจริญเป็นพืชต้นใหม่และมีปัญหาการกระจายตัว (somaclonal variation) เนื่องจากการเพาะเลี้ยงบนอาหารเป็นเวลานาน ดังนั้นการถ่ายฝากชิ้นส่วนดีเอ็นเอเข้าไปยังเซลล์พืชที่มีผนังเซลล์สมบูรณ์อยู่โดยตรงน่าจะดีกว่าและนักวิทยาศาสตร์ก็ได้พัฒนาเครื่องมือสำหรับยิง (bombardment) ลูกกระสุนขนาดเล็กที่มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอเคลือบอยู่เข้าไปในเซลล์พืชได้ (รูปที่ 9) ลูกปืนโลหะที่ทำด้วยทังสเตนมีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 1 ไมโครเมตร  จะถูกยิงใส่เซลล์พืชด้วยความเร็ว  430  เมตรต่อวินาที เนื้อเยื่อเป้าหมายอาจเป็นสารแขวนลอยของเนื้อเยื่อคัพภะที่ใส่ลงบน filter และวางในจานเพาะ หรืออาจเป็นใบพืช หรือเมล็ดของข้าวโพดก็ได้ เซลล์ที่อยู่ในวิถีกระสุนโดยตรงจะตาย แต่เซลล์ใกล้เคียงอาจถูกกระสุนขำแรกผ่านโดยที่ไม่ถูกฆ่า ผลการตรวจสอบทางกายภาพของใบพืชที่ถูกยิงด้วยกระสุนทังสเตนที่เคลือบด้วย GUS vector พบว่ากระสุนสามารถชำแรกผ่านอย่างน้อย 1 ชั้นเนื้อเยื่อคือผ่านชั้น epidermis ไปจนถึงชั้น mesophyll
          ผลการทดลองที่แสดงถึงประสิทธิภาพการถ่ายฝากยีนคือการศึกษาการสร้างสาร anthocyanin ที่ให้สีแดงในฝักข้าวโพด กระบวนการสร้างสารแอนโธไซยานินถูกควบคุมโดยยีน Lc ซึ่งเป็นยีนในตระกูลยีน R  ยีน Lc สังเคราะห์โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการจับดีเอ็นเอและเกี่ยวข้องกับการกระตุ้นกระบวนการ transcription เซทของยีนที่จะถ่ายฝาก (a construct) ถูกสร้างขึ้นโดยให้ยีน Lc อยู่ภายใต้การควบคุมของ CaMV promoter ซึ่งเป็นโปรโมเตอร์ที่แสดงออกตลอดเวลา ทำให้โปรตีนจากยีน Lc ถูกผลิตออกมาในปริมาณมาก กระสุนทังสเตนจะถูกเคลือบด้วยพลาสมิดที่มี construct อยู่ และจะถูกยิงเข้าใส่เมล็ดข้าวโพดกลายพันธุ์ที่ไม่สามารถสร้างเม็ดสีได้ (ปกติเนื้อเยื่อ aleurone จะมียีน R ที่สร้างเม็ดสีได้) หลังจาก 36 ชั่วโมงพบว่าเซลล์ในเนื้อเยื่อ aleurone ของเมล็ดข้าวโพดที่ถูกยิงจะสร้างเม็ดสีสีแดงขึ้นมาเนื่องจากกระบวนการสังเคราะห์สารแอนโธไซยานินถูกกระตุ้นให้ทำงานโดยยีน Lc 
          เทคนิค bombardment ใช้ได้ผลดีในการถ่ายฝาก reporter gene เข้าสู่เนื้อเยื่อคัพภะของข้าวโพด และนอกจากนี้ยังใช้ถ่ายฝากยีน bar ซึ่งเป็นยีนควบคุมการผลิตเอ็นไซม์ phosphinothricin acetyltransferase (PAT) ซึ่งมีฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของสาร phosphinothricin (PTT) ซึ่งเป็นองค์ประกอบของสารกำจัดวัชพืชจึงช่วยให้พืชปลอดภัยจากสารดังกล่าว เซลล์เนื้อเยื่อคัพภะที่ถูกถ่ายฝากยีนจะถูกคัดเลือกโดยนำไปเพาะเลี้ยงบนอาหารที่มี PTT ต้นพืชดัดแปลงพันธุกรรมที่พัฒนามาจากเซลล์เหล่านี้ก็จะต้านทานต่อสารกำจัดวัชพืชที่ฉีดพ่นลงบนใบได้ ดังนั้นเทคนิค bombardment จึงมีศักยภาพมากมายในการทดลองถ่ายฝากยีนในข้าวโพด

ภาพที่ 8 Systemic infection ด้วย Geminivirus vector ที่ดัดแปลงพันธุกรรม ---->

              Tomato golden mosaic virus (TGMV) มีดีเอ็นเอเป็นวงแหวนสายเดี่ยวขนาด 2.5 kb จำนวน 2 โมเลกุล อยู่ภายในโปรตีนห่อหุ้ม (protein coat) DNA A มียีนสำหรับผลิตโปรตีนห่อหุ้มและโปรตีนที่จำเป็นสำหรับการจำลองตัวของดีเอ็นเอ ส่วน  DNA B จำเป็นสำหรับการเข้าระบาดทำลายเซลล์พืช ส่วนของยีนสำหรับผลิตโปรตีนห่อหุ้มของ DNA A จะถูกกำจัดออกไปและนำเอายีนที่ต้องการถ่ายฝากตัดต่อเข้าไป ไวรัสจะระบาดเข้าสู่เซลล์พืชทุกเซลล์รวมทั้งนำเอายีนที่ต้องการถ่ายฝากเข้าไปด้วย เทคนิคนี้ช่วยแก้ปัญหาเรื่องการพัฒนาเซลล์ที่ถ่ายฝากยีนให้เป็นพืชต้นใหม่เพื่อใช้ตรวจสอบการทำงานของเวคเตอร์ระบบนี้ยีน NPTII จะถูกตัดต่อเข้าไปใน DNA A ระหว่าง LB และ RB แล้วก็ถูกถ่ายทอดเข้าสู่เซลล์ของ Agrobacterium สารละลายที่มี Agrobacterium จะถูกฉีดเข้าสู่ต้นพืชที่ถูกถ่ายฝาก T-DNA ที่มี DNA B จำนวน 2 โมเลกุล เข้าไปก่อนหน้านี้แล้ว ภายในสามสัปดาห์ไวรัสจะแพร่กระจายไปสู่เซลล์พืชทั้งต้น จากการตรวจสอบด้วยวิธี Southern Blot Hybridization พบว่าในใบพืชจะมี DNA A และ DNA B อยู่ และจากการตรวจสอบทางเคมีพบว่าระดับกิจกรรมของยีน NPTII จะสูงมาก ต่อมาได้มีการพัฒนาระบบ Binary vector โดยตัดต่อส่วนของทั้ง DNA A และ DNA B ให้อยู่ด้วยกัน ดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องถ่ายฝาก DNA B เข้าสู่ต้นพืชก่อนฉีด DNA A เข้าไปภายหลัง

 

   
   

<---- ภาพที่ 9 การถ่ายฝากชิ้นส่วนดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์พืชโดยตรงด้วยกระสุนเคลือบดีเอ็นเอ

                ดีเอ็นเอจะถูกเคลือบโดยวิธีตกตะกอนกับแคลเซียมคลอไรด์ลงบนกระสุนทังสเตนหรือกระสุนทองขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 1 mm เม็ดกระสุนขนาดเล็กนี้จะถูกวางบนส่วนปลายของกระสุนพลาสติดที่มีขนาดใหญ่กว่า แล้วถูกบรรจุในรังปืนที่ถูกออกแบบมาเพื่อการนี้โดยเฉพาะ ชิ้นส่วนเนื้อเยื่อพืชหรือเซลล์แขวนลอยที่เป็นเป้าหมาย จะถูกวางไว้ที่ปลายอีกด้านหนึ่งของรังเพลิง เมื่อกระสุนพลาสติคถูกยิงออกไป จะถูกกั้นเอาไว้ ส่วนเม็ดกระสุนขนาดเล็กที่เคลือบดีเอ็นเอไว้จะพุ่งผ่านรูเล็กๆและแทรกเข้าสู่เซลล์เป้าหมาย ภายในรังเพลิงและห้องบรรจุเนื้อเยื่อเป้าหมายจะต้องอยู่ในสภาพสูญญากาศ ไม่เช่นนั้นอากาศภายในจะทำให้ความเร็วกระสุนลดลง เซลล์พืชสามารถทนทานสภาพสูญญากาศได้นานประมาณ 2 นาที หลังการยิงเซลล์จะถูกถ่ายลงบนจานเพาะที่มีเซลล์พี่เลี้ยงอยู่ แล้วก็จะเพาะเลี้ยงตามขั้นตอนจนสามารถพัฒนาเป็นพืชต้นใหม่ได้


การยิงด้วยกระสุนเคลือบดีเอ็นเอสามารถใช้ผลิตอวัยวะภายในเซลล์ที่ดัดแปลงพันธุกรรมได้
            ในพืชนอกจากดีเอ็นเอที่อยู่ภายในนิวเคลียสแล้วยังมีดีเอ็นเอในคลอโรพลาสอีกด้วยซึ่งส่วนใหญ่จะมียีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการสังเคราะห์แสง ซึ่งนักวิทยาศาสตร์ที่ต้องการศึกษายีนในคลอโรพลาสจะใช้เทคนิค bombardment เช่นที่ทำการศึกษาในสาหร่ายเซลล์เดียว Chlamydomonas ซึ่งมีคลอโรพลาสโมเลกุลเดียวและมีขนาดใหญ่ แต่พืชโดยทั่วไปมีคลอโรพลาสขนาดเล็กและมีหลายโมเลกุล อย่างไรก็ตามการถ่ายฝากยีนสู่คลอโรพลาสก็สามารถทำได้สำเร็จในยาสูบโดยถ่ายฝากยีนสำหรับ 16S rRNA ที่กลายพันธุ์ทำให้ต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ spectinomycin และ streptomycin (รูปที่ 10) เมื่อนำเซลล์ถ่ายฝากยีนไปเลี้ยงบนอาหารเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมต้นพืชที่มีคลอโรพลาสที่มียีนต้านทานยาปฏิชีวนะจะมีสีเขียวแต่ต้นที่ไม่มียีนนี้จะมีสีขาว ใบพืชจากต้นสีขาวจะถูกยิงด้วยกระสุนเคลือบยีนถ่ายฝากแล้วตัดเป็นชิ้นเล็กๆ และนำไปเลี้ยงบนอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ กลุ่มของแคลลัสสีเขียวจะพัฒนาขึ้นบนชิ้นใบสีขาว แต่สามารถแยกโคลนที่มียีนถ่ายฝากได้แค่ 3 โคลนเท่านั้น นักวิทยาศาสตร์ประเมินว่าประสิทธิภาพของการถ่ายฝากยีนในคลอโรพลาสจะต่ำกว่าในนิวเคลียสประมาณ 100 เท่า แต่จากผลการทดลองก็พบว่าเมล็ดจากต้นที่ผสมตัวเองจะต้านทานยาปฏิชีวนะ spectinomycin และความต้านทานนี้จะถ่ายทอดทางแม่ผ่านรังไข่ แต่เหตุผลที่ทำให้เทคนิคนี้ใช้ได้ผลก็ยังไม่เป็นที่แน่ชัดเพราะคลอโรพลาสเป็นอวัยวะที่มีขนาดเล็กและลูกกระสุนทังสเตนก็มีขนาดใหญ่เกินที่จะชำแรกผ่านคลอโรพลาสได้

 ยีนของพืชสามารถทำการโคลนได้โดยใช้ Transposable elements
              นักอณูชีววิทยาได้ใช้ transposable elements หรือ transposons ในการค้นหาและโคลนยีนได้หลายยีน เช่นงานวิจัยในข้าวโพดโดย บาร์บารา แมคคลินทอค สำหรับ transposon ที่นิยมใช้ในงานวิจัยมากคือ Activator (Ac) ซึ่งถูกค้นพบและโคลนออกมาได้เนื่องจากมันทำให้เกิดการกลายพันธุ์ในยีน Waxy และลำดับŬ